可能的原因和对应的解决方案如下:引物用量偏大,引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。循环的次数过多。适当增加模板的量,减少循环次数。酶的用量偏高或酶的质量不好,应降低酶量或调换另一来源的酶。退火温度偏低,退火及延伸时间偏长。应提高...
PCR实验室又叫基因扩增实验室。PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称。是一种分子生物学技术,用于放大特定的DNA片段,可看作生物体外的特殊DNA复制。通过DNA基因追踪系统,能迅速掌握患者体内的病毒含量,其精确度高达纳米级别。
Pcr实验室又叫基因扩增实验室。PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称。是一种分子生物学技术,用于放大特定的DNA片段,可看作生物体外的特殊DNA复制。通过DNA基因追踪系统,能迅速掌握患者体内的病毒含量,其精确度高达纳米级别,精确检测乙肝病毒在患者体内存在的数量、是否复制、是否传染、传染性有多强、是否必要服药、肝功能有否异常改变能及时判断病人最适合使用哪类抗病毒药物、判断药物疗效如何、给临床治疗提供了可靠的检验依据。
荧光定量 PCR(Realtime fluorescence quantitative PCR,qPCR)也称作实时荧光定量 PCR。它是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时检测整个 PCR 进程,最后通过标准曲线对初始模板进行定量分析的方法。该技术于 1996 年由美国 Applied Biosystems 公司推出,它的出现解决了传统 PCR 不能对初始模板定量分析的问题。荧光定量 PCR 具有准确性高、灵敏度高、特异性强等优点,目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。
荧光定量 PCR 原理
在 PCR 反应体系中加入荧光基团,随着 PCR 反应的进行,PCR 反应产物不断累积,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环收集一个荧光强度信号,通过荧光强度变化检测产物量的变化,最终得到得到一条荧光扩增曲线图,扩增曲线横坐标表示循环数,纵坐标表示荧光强度。
荧光定量 PCR 常用术语
在了解荧光定量 PCR 如何对初始模板进行定量之前,需要了解几个在荧光定量 PCR 分析中常用的术语:
基线:实时荧光定量 PCR 反应的基线是指在 PCR 的最初几个循环中(一般为 3-15 个循环)的信号水平。此阶段的荧光信号变化量极小。低水平的基线信号相当于反应的背景或噪声。每个实时荧光定量 PCR 反应的基线应通过用户分析或扩增曲线自动分析,根据经验确定。基线的设置,会影响到荧光阈值及 Ct 值。
荧光阈值:荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上,但一般荧光阈值的缺省值是 PCR 反应前 3-15 个循环荧光信号标准偏差的 10 倍。
CT 值:CT 值指的是 PCR 扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。
标准曲线:标准曲线是标准物质的物理/化学属性跟仪器响应之间的函数关系。对已知拷贝数的标准样品做系列稀释,对不同稀释度的标准样品进行荧光定量 PCR 并记录 Ct 值,根据 Ct 值及拷贝数的对数绘制得到标准曲线,标准曲线的纵坐标代表起始拷贝数的对数,横坐标代 Ct 值。
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