一、实验原理：

细胞活力检测试剂盒(CCK-8) 可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。

其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】。

在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。

生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。CCK-8法是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法,可替代传统的MTT法。

二、用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。

三、优点： 使用方便，无需洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂。

CCK-8法能快速检测。CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度。 CCK-8法的重复性优于MTT 法，产生的formazan 是水溶性的，减少因洗涤和溶解带来的误差。

 CCK-8法对细胞毒性小，可以多次测定选取最佳测定时间，与MTT 方法相比线性范围更宽，灵敏度更高。

下面开始讲实验步骤，

其实每个公司的实验步骤都大同小异，我在分享步骤的同时，也会分享一点小窍门。
1.先用细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数量（此处也多说一句，细胞最好不要超过10^8/mL,细胞一定要吹打均匀，呈单细胞，呈单细胞，呈单细胞），然后准备接种细胞；
2.倍比稀释一个细胞浓度梯度，在96孔板中，我常规稀释的浓度如下：1000, 2000,5000,10000,15000,20000,25000,50000个/孔，共8个浓度。每组 4-6 个复孔，每孔100 μL 培养基（此处培养基不需要加抗生素）；
3.接种后根据细胞的类型不同，悬浮细胞通常培养4小时。贴壁细胞根据细胞种类不同，培养 2-4 小时，主要使细胞贴壁又没开始进入分裂期（注意使用排枪将）。
4.然后每 100 μL 培养基加 10 μL CCK-8溶液。要是实验技术不成熟，害怕没有完全把液体加进去的，我用过的两种解决办法，一种是加完后，使用水平离心机，500G，1min，短暂离心；另外一种是将CCK8放入培养基中制成10%的液体，对细胞进行换液。后一种方法有一些些弊端，下周仔细分析。
5.一般的试剂盒说明书会告诉你，试剂培养一定时间后测定 OD 值。那这个一定的时间是多少呢，这个需要你自己在做标曲时就应该清楚。我通常会在加入CCK8液体后观察液体颜色的变化，在1小时开始测定OD值，湖面基本每隔1小时测一次，总共测6-8次。
6.关于测定波长，一般的试剂盒推荐使用450nm吸光度。用双波长进行测定，检测波长450nm，参比波长600nm。
7.最后制作出一组以时间为为横坐标，OD值为纵坐标的多条曲线及一条以细胞数量为横坐标，OD值为纵坐标的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量。使用此标准曲线的前提条件是试验条件完全一致。

之前做的HeLa 229细胞举一个例子

1.Hela 229按0，1000, 2000,5000,10000,15000,20000,25000,50000个/孔铺板细胞的贴壁时间从铺板后1小时开始（康宁的96孔板，每个牌子的孔板细胞贴壁时间是不一样的，对了血清也会影响细胞贴壁，所以一定要做预实验），4小时基本可以完全贴壁，6小时就开始有细胞在增殖，进入分裂期。所以在我的这个体系下，做标曲选择时间为铺板后4小时，细胞培养基为100μL。

2.细胞贴壁完全后，使用量程为2-20μL 的排枪加入10μL CCK-8溶液，轻轻混匀。

3.Beckman水平离心机短暂离心，500G，1min。

4.取出放入孵箱，每隔一个小时测定2次读数，检测波长450nm，参比波长600nm。一共读取6次读数。

5.用其他孔细胞数值减去细胞数为0孔，得到一组数据。
6.制作以时间为为横坐标，OD值为纵坐标的多条曲线，如下图2

从图2我们可以知道在加入CCK8 4小时时，各个细胞稀释浓度的读数较稳定，所以我们选择4小时的数值做一组以细胞数量为横坐标，OD值为纵坐标的标准曲线，如下图4

标准曲线可以做线性的，但我个人比较喜欢二项式。
其实标准曲线的建立也就是我们正式实验的良好基础。从上述标准曲线中，我可以知道在96孔板中到我检测的时候，细胞数在5000-25000个的时候比较准确。另外我还知道在加入CCK8 4小时检测效果比较好。大家注意哈是在检测时，而不熟铺板时。那怎么粗略计算铺板时的细胞数呢？

需要考虑以下几个问题：

1.细胞的增殖速度，多少小时繁殖一代。（这里又涉及到，不同的铺板浓度，不同代数的细胞增殖速度不一样）
2.实验所需时间，你加了药物或者做了什么处理后，多少小时测定。

细胞活性检测

1.在 96 孔板中接种单细胞悬液 (100 μL/孔) ，放在孵箱中培养
12-24 小时。
2.在每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要产生气泡) 。
3.短暂离心（可选择不做）。
4.将培养板置于培养箱内孵育 1-6 小时；
5.用酶标仪测定在 450 nm 处及600 nm处的吸光度。

细胞增殖-毒性检测

1.在 96 孔板中接种细胞悬液 (100 μL/孔) ，放在孵箱中培养
12-24 小时。
2.在每一空中加入不同浓度的待测药物。
3.将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（预实验结果或者根据文献报道）。
4.在每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要产生气泡) 。
5.短暂离心（可选择不做）。
6.将培养板置于培养箱内孵育 1-6 小时；
7.用酶标仪测定在 450 nm 处及600 nm处的吸光度。
我们都知道CCK8反应原理是一个氧化还原反应，那如果你的药物是氧化还原反应相关的药物，加入CCK8反应之前，更换新鲜培养基（如果操作不当会影响结果）。当待测药物影响较小时可以直接去除培养基中加入待测药物后的空白吸收即可。

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