原代细胞：是指直接从机体取出的组织或细胞获得单个细胞并在体外进行培养的细胞。

原代细胞分离实验原理：体外将动物某组织，经酶法或机械处理法分离成单细胞，并在合适的培养基中筛选出特定细胞，使得目的细胞得以生存、生长和繁殖，称为原代细胞分离。

原代细胞分离培养：取材--分离--培养--鉴定

首先将组织从机体中取出，经胰蛋白酶/胶原酶处理后分散成单细胞，再在合适的培养基中培养，使细胞繁殖到一定系数后进行细胞鉴定。

实验步骤：

取8d左右雄性SD大鼠，颈椎脱臼处死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

在超净工作台中，将大鼠打开颅腔后取出全脑,放在盛有预冷的PBS玻璃培养皿中，去除小脑和间脑。

将大脑半球在干滤纸上缓慢滚动以去除软脑膜和脑膜大血管，再放在新的盛有预冷的PBS玻璃培养皿中。

用细解剖镊去除大脑白质、残余大血管和软脑膜，保留大脑皮质。

大脑皮质放于含庆大霉素和谷氨酰胺DMEM中，剪碎成约1mm3大小，放入50ml的离心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型胶原酶，0 .025-0 .05％IV型胶原酶，200-400U DNaseI)，混匀后37℃水浴消化1-1.5h。

室温1 000×g离心8min，去上清液。

沉淀中加入20％BSA重悬浮，充分混匀，1 000×g，20min，4℃离心，去上清。

沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的胶原酶/分散酶，0.05-0.1％I型胶原酶，100-300U DNaseI )重悬浮，混匀，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室温离心6min，去上清液。

沉淀加入2ml DMEM(含庆大霉素和谷氨酰胺)培养液悬浮混匀，铺于经离心形成连续梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃离心10min。

靠近底部的红细胞层之上的白黄色的层面即为纯化的微血管段，吸出后DMEM漂洗两次(离心1000×rpm，6min，室温)，去上清液。 

加入DMEM完全培养液(20％FBS，4ug/ml嘌呤霉素 )重悬浮，接种于含5％的大鼠 血清37℃孵育过夜所制备的细胞培养皿中，置于37℃、5％CO2培养箱内静置培养24h后更换不含嘌呤霉素的混合培养基，随后隔天换液。

原代细胞和细胞系的比较

原代细胞的应用

由于原代细胞生物学特性未发生很大改变，最接近和反映体内生长特性，因此是：

(1) 研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的工具；

(2)更好实现精准医疗的肿瘤诊治模式，实现个体化精准用药的目的。

常见问题解答：

问：为什么我取得原代肿瘤组织，分离的却不是肿瘤细胞？

答：取材时，我们要熟悉所需组织的类型和部位特征，选择肿瘤细胞集中、活力较好的部分。避免结缔等正常组织。

问：为什么离心后，没有细胞分离出来？

答：需要考虑消化酶的因素，由于肿瘤组织较致密，胰酶无法消化，一般选用胶原酶，如胶原酶Ⅳ。若是组织十分致密可以再结合机械法，如研磨或者搅拌加速细胞分散。

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