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免疫荧光实验的几个问题

发布日期:2022-10-31 09:43:35 浏览次数:

参考见解:最好是同一视野在未用荧光激发下进行对照,看是否非特异性染色
(1)空白对照:如果你作的是石蜡切片的免疫组化,这一个对照必须有,目的是看自发荧光。脱蜡后直接在荧光显微镜下观察。
(2)阴性对照:标本直接滴加二抗,呈阴性反应。
(3)抗原对照:标本加同种动物的未免疫血清,以PBS冲洗后,在加抗免疫球蛋白荧光抗体。因未免疫动物的血清中无特异性抗体,应呈阴性反应。
参考见解:只是固定方法不同,细胞固定用甲醇,切片固定用多聚甲醛,而染色方法是一样的。
(1)你的二抗是用FITC标记的,为避免荧光分解,分装及荧光显微镜观察时均要避光。
(2)封片最好用甘油加0。5mmol/L pH9。0-9。5的碳酸氢盐缓冲液,后者能使玻片透明更亮。
(3)关于免疫酶染色,如果是用过氧化物酶做标记,就必须用3%H2O2以去除内缘性过氧化物酶。

(4)如果要做苏木素复染,可用盐酸溶液去除苏木素。

(5)其余同一般操作。

参考见解:激光共聚焦显微镜的分辨率比普通荧光显微镜要高的多,出现上述现象首先要排除荧光显微镜的问题,如是不是紫外灯泡寿命到期了或者别的原因,荧光显微镜没有问题,那就以共聚焦显微镜的结果为主。抗体分装、及荧光显微镜观察结果是否一定要在暗室中进行实验。
1. 首先我们要熟悉激光共聚焦的使用方法,开机和关机顺序要注意,尤其是激光器的使用,务必要预热 10 到 15 分钟方可打开激光。
2. 在 smart set up 中选择 best signal,对应相应的激光波长选择相应的颜色(488-FITC,568-RHOD,647-White,后期也可在软件中进行修改)。
3. 拍摄过程中要注意选择的像素和拍摄速度,一般选择 1024*1024,speed 为 5-7。
4. Pinhole 值不宜过大,在操作过程中可点击 1AU-Max,获得荧光强度适宜的图层。

5. 为拍摄出完美的荧光图,可通过调整 Gain 值改变荧光强度,再通过调整 Digital Offset 和 Digital Gain 来降低背景噪音以及调整荧光强度。


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