免疫沉淀及衍生实验的注意事项(三）

免疫沉淀（IP）是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“Protein A/G”特异性地结合到抗体（免疫球蛋白）的Fc片段的现象开发出来的方法。目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的protein A/G就能达到吸附抗原的目的，通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。

免疫共沉淀（Co-IP）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质是否在生理条件下有相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用蛋白。

染色质免疫沉淀（ChIP）是研究体内DNA与蛋白质相互作用的重要工具。它的基本原理是在生理状态下把细胞内的蛋白质和DNA交联在一起，超声波将其打碎为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过所要研究的目的蛋白质特异性抗体沉淀此复合物，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片段进行PCR检测，可以知道目的蛋白与哪些基因作用。

实验操作中所要注意的关键点

免疫沉淀：因为免疫沉淀的目的主要是通过抗体和目的蛋白相互作用从而捕获目的蛋白，所以实验中要注意的关键点是抗体和目的蛋白相互作用的效果。其主要受抗体的结合能力，目的蛋白和抗体的可接触性两个因素影响。所以免疫沉淀实验中的关键因素是抗体的选择以及裂解缓冲液中的配方。对于前者而言，抗体所针对的作用表位必须处于目的蛋白表面，对抗体结合力的要求和免疫印迹或者免疫荧光相比要高得多；对于后者而言，主要考虑因素是缓冲液中的去垢剂成分能否在不破坏目的蛋白天然构像的情况下（不影响目的蛋白和抗体的相互作用效果）将目的蛋白从细胞局部定位（比如位于某些细胞器中）中有效释放出来。

免疫共沉淀：免疫共沉淀的目的是通过抗体和目的蛋白的相互作用从而捕获目的蛋白复合物，最终检测目的蛋白复合物中各成分之间的相互作用，所以实验中要注意的关键点和免疫沉淀相比，除了要注意抗体和目的蛋白相互作用的效果外，还要注意目的蛋白复合物的完整性，后者主要考虑因素是缓冲液中的去垢剂成分能否在有效释放目的蛋白复合物进入可溶相的情况下不破坏目的蛋白复合物中各成分之间的相互作用。所以，免疫共沉淀实验中的关键因素除了抗体的选择外，裂解缓冲液配方中的去垢剂的成分和浓度对免疫共沉淀实验的成功与否至关重要，其选择相比免疫沉淀实验而言，要求更严格。

染色质免疫共沉淀：染色质免疫共沉淀的主要目的是通过抗体和目的蛋白的相互作用从而捕获和目的蛋白有相互作用的DNA片段，最终检测目的蛋白和DNA片段的相互作用。因此，实验中要注意的关键点和前二者（免疫沉淀和免疫共沉淀）有所不同。因为在实验中蛋白质-DNA复合物的维持需要依靠多聚甲醛的交联作用，所以目的蛋白的许多表面表位也在交联过程中丧失。因此，除了后续的基本操作和免疫沉淀以及免疫共沉淀有些许不同，有额外需要注意的是，其对抗体的要求要比免疫沉淀和免疫共沉淀高得多，相对而言，裂解缓冲液的成分并不是关键因素。

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