TUNEL染色可检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理是标记（荧光或者生物素）的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3‘－OH末端，再通过荧光激发或者化学显色的方法，特异准确地检测发生凋亡的细胞，而正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。本实验适用于组织和细胞样本的凋亡原位检测。

实验步骤：

1 细胞样品：自然晾干的细胞样品固定；封闭；通透液促渗

冰冻样本：PBS浸润；封闭；通透液促渗

石蜡样品：脱蜡及水化；微波或蛋白酶K修复；封闭

2 标记反应

荧光标记：滴加TdT酶反应液，反应；荧光显微镜检测

生物素标记：滴加TdT酶工作液反应；滴加Streptavidin-HRP工作液反应；DAB显色；苏木素复染；显微镜观察拍照

细节注意：

A、脱蜡和水化

脱蜡可以先 60ºC 20 min，再用使用二甲苯两次 5-10 min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀

B、细胞通透

 一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用 10-30 min，几 μm 切片用短时间；几十 μm 切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内

C、TUNEL 反应液的时间

一般是37ºC 1 h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至 2 h，但要结合你最终的背景着色

D、DAB显色条件的选择

一般 DAB 反应10 min 左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过 30 min；promega 公司提供的 DAB 液（桃红色）

E、PBS的充分清洗

在 TUNEL 反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达 5 次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色

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