如何解决孔内细胞中间密两边稀的问题

这是典型的“过犹不及”。我们在接种细胞的时候通常使用“十字摇匀法”，即前后、左右各来回几次。但很多人担心摇的次数少会造成细胞分布不均匀，就反复多次地摇，结果细胞全部集中在中间。其实只要把握好幅度和力度，前后、左右交替摇三四次就已经足够了，不论孔板、皿或者培养瓶。对于孔板这样的较小的容器，实际每孔加的培养基总量不会超过2mL，不如直接用合适的移液枪在孔板内吹打之后放平，更能获得良好的效果。

✅ 细胞活力及浓度：细胞应在生长良好、致密度约为80-90％、活力达90%以上的状态下冻存。细胞活力差的细胞在冻存后的成活率很小，因此，一定要在细胞分裂旺盛时期冻存。

✅ 冻存密度：冻存时细胞密度少于5×105个活细胞/mL时，很难成功复苏。

✅ 冻存管盖子拧紧：冻存管的盖子一定要拧紧，否则水浴复苏时水会渗入造成污染。

✅ 冻存时间：细胞不可长期保存在-80℃冰箱中。我们建议在-80℃冰箱中的保存时间不要超过48h。

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