免疫组化实验原理和步骤

实验原理：

抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学正是利用了这一原理。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。

实验材料：

（一）仪器设备

18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉、水浴锅

（二）试剂

1、PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L、KCl 2.7mmol/L 、Na2HPO4 4.3mmol/L、KH2PO4 1.4mmol/L。

2、0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g、柠檬酸0.4g。3、0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226；2H2O，用10mmol/L NaOH调至ph8.0，加水至1000ml。

4、1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至ph8.0, 加水1000ml。

5、 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。

6、3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。

7、风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（ph9.0–9.5）等量混合b 油和TBS(PBS)配制

8、TBS/PBS PH9.0–9.5，适用于荧光纤维镜标本；ph7.0-7.4适合光学纤维标本。

实验步骤：

（一）脱蜡和水化：

脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。

1、 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟。

2、无水乙醇中浸泡五分钟。

3、 95%乙醇中浸泡五分钟。

4、75%乙醇中浸泡五分钟。

（二）抗原修复：

用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：

1、抗原热修复

（1）高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m柠檬酸钠缓冲溶液（ph6.0）。盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。

（2）沸热修复电炉或水浴锅加热0.01柠檬酸钠缓冲液（ph6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。

（3）微波炉加热在微波炉里加热0.01柠檬酸钠缓冲液（ph6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。适用的抗原Bcl-2、ax、AR、PR、C-fos、x-jum、z-kit、c-myc、E-cadherin。ChromograninA、Cyclin、ER、Heatshock、Protein、HPV、Ki-67、MDMZ、P53、P34、P15、P-glycoprotein、PKC、PCNA、ras、Rb等

2、酶消化方法

常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热37℃，消化时间约为5-30分钟。适用于被固定遮蔽的抗原：包括Collagen、GFAP、Complement、Cytokeratin、C-erB-2、LCA、LN等。

（三）免疫组化染色SP法

1、脱蜡、水化。

2、PBS洗2-3次各5分钟。

3、3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室温静置10分钟。

4、PBS洗2-3次各5分钟。

5、抗原修复。

6、PBS洗2-3次各5分钟。

7、滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体。

8、滴加Ι抗50μl,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时。

9、4℃过夜后需在37℃复温45分钟。

10、PBS洗3次每次2分钟。

11、滴加Ⅱ抗45-50μl,室温静置或37℃1小时。

12、Ⅱ抗中可加入0.05%的tween-20。

13、PBS洗3次各5分钟。

14、DAB显色5-10分钟，在显微镜下掌握染色程度。

15、PBS或自来水冲洗10分钟。

16、苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化。

17、自来水冲洗10-15分钟。

18、脱水、透明、封片、镜检。

（四）SABC法

1、脱蜡、水化 。

2、PBS洗2次各5分钟。

3、用蒸馏水或PBS配制新鲜的3%H2O2，室温封闭5-10分钟，用蒸馏水洗3次（4）抗原修复。

4、PBS洗5分钟。

5、滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体。

5、滴加Ι抗50μl,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时。

6、PBS洗3次各2分钟。

7、滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20分钟。

8、PBS洗3次各2分钟。

9、滴加试剂SABC 20℃-30℃ 20分钟。

10、PBS洗4次各5分钟。

11、DAB显色：试剂盒或自配显色剂显色。

12、脱水、透明、封片、镜检。

免疫组化问题解答

1、染色过强

 a 抗体浓度过高戒孵育时间过长 。降低抗体滴度、抗体孵育时间：室温1小时、或4度过夜

 b 孵育温度过高超过37度。 一般在室温20-28度 c DAB显色时间过长戒浓度过高 显色时间不超过5-12分钟，以显微镜下观察为准。

2、非特异性背景染色

a 操作过程中冲洗不充分 ：每步冲洗3次每次5分钟。

b 组织中含过氧化物酶未阻断：可再配置新鲜3%H2O2封闭孵育时间延长。

c 组织中含内原性生物素：正常非免疫动物血清再封闭。

d 血清蛋白封闭不充分：延长血清蛋白封闭时间。

3、染色弱

a 抗体浓度过低、孵育时间过短：提高抗体浓度、孵育时间不能少于60分钟。

b 试剂超过有效使用时间：应更换试剂。

c 操作中添加试剂时缓冲液未沥干：每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液使试剂稀释（应防止切片干燥）。

d 室温太低：低于15度，要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟，或4度冰箱过夜。

e蛋白封闭过度：封闭不要超过12分钟。

4、染色阴性

a 操作步骤错误：应重试、设阳性对照。

b 组织中无抗原：设阳性对照以验证试验结果。

c 一抗不二抗种属连接错误：仔细确定一抗二抗种属无误。

具体沟通：400-9688-170

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