免疫共沉淀(Co-IP)原理及步骤（二）

免疫共沉淀(Co-IP)原理及步骤(二)

一．实验流程

（1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C，最大转速离心30 min后取上清；

（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；

（3）取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min；

（4）将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连；

（5）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟；

（6）SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析，通过免疫共沉淀确定结合蛋白。

 二．注意事项

（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40 或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的 cocktailer。

（2）确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；

（3）要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；

（4）确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。

三．RIPA Buffer配制:

 RIPA蛋白酶抑制剂：

配制100ml的modified RIPA buffer： 工作液配制：

1. 称取790mg 的Tris-Base，加到75ml 去离子水中，加入900mg的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl调节PH值到7.4；

2. 加10 ml 10%的NP-40；

3. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清；

4. 加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存；

5. 理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 μl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 μl），但是PMSF在水溶液中很不稳定，30min就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。

RIPA蛋白酶抑制剂：

 试验步骤仅供参考哦！

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