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免疫荧光细胞化学染色

发布日期:2022-10-27 09:36:35 浏览次数:

免疫荧光细胞化学染色方法

可制作涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片,经适当固定或不固定,作免疫荧光染色用。

(一)直接法
1.染色切片经固定后,滴加经稀释至染色效价如 1:8 或 1:16 的荧光抗体(如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体或兔抗人 IgG 或 IgA 荧光抗体等),在室温或 37℃ 染色 30 min,切片置入能保持潮湿的染色盒内,防止干燥。
2.洗片 倾去存留的荧光抗体,将切片浸入 pH7.4 或 pH7.2PBS 中洗两次,搅拌,每次 5 min,再用蒸馏水洗 1 min,除去盐结晶。
3.用 50% 缓冲(0.5mol/L 碳酸盐缓冲液 pH9.0~9.5)甘油封固、镜检
4.对照染色
①正常免荧光血清染色,如上法处理切片,结果应为阴性。
②染色抑制试验(一步法):将荧光抗体和未标记的抗体球蛋白或血清(相同)等量混合,如上法处理切片。结果应为阴性。为证明此种染色抑制不是由于荧光抗体被稀释所致,可用盐水代替未标记抗血清,染色结果应为阳性。此法结果较二步法稳定。
③类属抗原染色试验,前面已作叙述。
直接法比较简单,适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研究。此法每种荧光抗体只能检查一种相应的抗原,特异性高而敏感性较低。
(二)间接法
(1)切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上,置于染色盒中保持一定的湿度,37℃ 作用 30 min。然后用 0.01mol/l pH7.2PBS 洗两次,10 min,用吸水吸去或吹干余留的液体。
(2)再滴加间接荧光抗体(如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体等),同上步骤,染色 30 min,37℃,缓冲盐水洗两次 10 min,搅拌,缓冲甘油封固,镜检。
对照染色:①抗体对照:用正常兔血清或人血清代替免疫血清,再用上法进行染色,结果应为阴性。②抗原对照:即类属抗原染色,亦应为阴性。③阳性对照。
间接法中上述方法称双层法(Double Layer Method)。另一种称夹心法,即用未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合,再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上,而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在,方法步骤如下:
①切片或涂片固定后,置于染色湿盒内。
②滴加未标记的特异性抗原作用切片于 37℃,30 min。
③缓冲盐水洗 2 次,每次 5 min,吹干。
④滴加特异性荧光抗体再用切片于 37℃,30 min。
⑤如③水洗。
⑥缓冲甘油封固,镜检。
间接法只需制备一种荧光抗体可以检出多种抗原,敏感性较高,操作方法较易掌握,而且能解决一些不易制备动物免疫血清的病原体(如麻疹)等的研究和检查,所以已被广泛应用于自身抗体和感染病人血清的试验。
(三)补体法
1.材料
(1)免疫血清 60℃ 灭活 20 min,用 Kolmers 盐水作 2 倍稀释成 1:2,1:4,1:8……。补体用 1:10 稀释的新鲜豚鼠血清,抗补体荧光抗体等,按下述的补体法染色。免疫血清补体结合的效价,如为 1:32 则免疫血清应作 1:8 稀释。
(2)补体用新鲜豚鼠血清一般作 1:10 稀释或按补体结合反应试管法所测定的结果,按 2 单位的比例,用 Kolmers 盐水稀释备用。Kolmers 盐水配法:即在 pH7.4、0.1mol/L 的磷酸缓冲盐水中,溶解 MgSO4 的含量为 0.01% 浓度。
(3)抗补体荧光抗体:在免疫血清效价为 1:4,补体为 2 单位的条件下,用补体染色法测定免疫豚鼠球蛋白荧光抗体的染色效价,然后按染色效价 1:4 的浓度用 Kolmers 盐水稀释备用。
2.方法步骤
(1)涂片或切片固定。
(2)吸取经适当稀释之免疫血清及补体之等量混合液(此时免疫血清及补体又都稀释一倍)滴于切片上,37℃ 作用 30 min,置于保持一定湿度的染色盒内。
(3)用缓冲盐水洗 2 次,搅拌,每次 5 min,吸干标本周围水液。
(4)滴加经过适当稀释之抗补体荧光抗体 30 min,37℃,水洗同(3)。
(5)蒸馏水洗 1 min,缓冲甘油封固。
3.对照染色
(1)抗原对照。
(2)抗血清对照:用正常兔血清代替免疫血清。
(3)灭活补体对照:将补体经 56℃30 min 处理后,按补体同样比例稀释,与免疫血清等量混合后,进行补体法染色。
本法之荧光抗体不受免疫血清的动物种属的限制,因而一种荧光抗体可作更广泛的应用,敏感性亦较间接法高,效价低的免疫血清亦可应用,节 省免疫血清,尤其是对检查形态小的如立克氏体、病毒颗粒等或浓度较低的抗原物质时甚为理想。
(四)抗原荧光抗体染色法
本法应用直接法或间接法的原理和步骤,可对活细胞在试管内进行染色,常用于 T 和 B 细胞、细胞培养物、瘤细胞抗原和受体等的检查和研究,阳性荧光主要在细胞膜上。FACS 即采用此法原理。
(五)双重染色法
在同一标本上有两个抗原需要同时显示(如 A 抗原和 B 抗原),A 抗原的抗体用 FITC 标记,B 抗原的抗体用罗达明标记,可采用以下染色方法:
1.一步法双染色 先将两种标记抗体按适当比例混合(A+B),按直接法进行染色。
2.二步法双染色 先用 RB200 标记的 B 抗体染色,不必洗去,再用 FITC 标记的 A 抗体染色,按间接法进行。
结果:A 抗原阳性荧光呈现绿色,B 抗原阳性呈现桔红色荧光。
(六)荧光抗体再染色法
若切片或其他标本经某种荧光抗体染色后,未获得阳性结果,而又疑有另外的病原体存在时,可用相应的荧光抗体再染色。
有时存档蜡块不能再用以切片,也可用存档的 HE 染色标本,褪去盖片和颜色,再作免疫荧光或其它免疫细胞化学的染色。

某些抗原可以用荧光素标记,制成荧光抗原,标记荧光素的方法与制备荧光抗体方法相同。用荧光抗原可以直接检查细胞或组织内的相应抗体,特异性较好,敏感性较差。染色方法同荧光抗体染色的直接法。由于多数抗原难以提纯或量少不昂贵,一般很少采用此法。


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