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酵母遗传学方法:酵母免疫荧光

发布日期:2022-10-26 11:31:40 浏览次数:

酵母免疫荧光

 1 )细胞制备

 1. 培养 5ml 酵母至对数生长早期( 106 ~ 107 细胞 /ml )。

2. 直接加 1/10 体积的甲醛到培养基里固定细胞(加入的甲醛终浓度为 3.7 %,标准母液是 37 %)。

3. 细胞在甲醛中培养至少 1 小时。

4. 离心收集细胞,用 0.1mol/L 磷酸钾( pH7.5 )洗一次。

5. 把细胞悬浮在 1ml  50mg/ml 消解酶 100T  50 单位 /ml 的溶细胞酶 [ 溶于含有 2ml/ml 6- 巯基乙醇的 0.1mol/L 的磷酸钾溶液中 ] 

6.  30 ℃培养 30 分钟,用相差显微镜检查原生质的生成率。细胞应呈黑色或半透明灰色,亮细胞(折射体)属于没有充分被消化的。菌蜕属消化过夜。

7. 离心收集细胞,悬浮在 1ml  PBS 中。

 2 )染色

 1.  10ml  1mg/ml 聚赖氨酸,放到用特氟隆封闭的( Teflonmasked slides )载玻片( 10 孔载玻片)上的每个孔,再用蒸馏水洗载玻片,干燥。

2.  10ml 固化细胞到每个孔中,几分钟后,用 PBS 抽洗 3 次。用显微镜检测载玻片确保呈合适的密度而不聚集。

3. 该步骤可任选(本实验不需要使用抗体,但建议使用):把载玻片浸泡在冷甲醇(- 20 ℃) 6 分钟后,然后放到冷丙酮(- 20 ℃) 30 秒,该处生理产生扁平细胞,有助于细胞骨架的观察。对于一些抗体 - 抗原结合物,需要这些步骤重新活化,用 PBS 重新润湿玻孔。

4.  15ml  PBS  3  BSA (牛血清白蛋白)组成的阻断缓冲液到玻孔中。在保湿盒子中,如垫有湿纸巾的平板中保温 30 分钟。重要的是,在这期间不能让载玻片孔干透( BSA 可通过阻断蛋白质结合位点降低非特异抗体结合到载玻片)。

5. 吸出阻断缓冲液,用 PBS  3  BSA 洗两次。

6.  10  15ml 第一抗体(溶解在 PBS  3  BSA )到载玻片孔中,在一个保湿盒中保温 1 小时。用亲和纯化抗体或单克隆抗体,如果可能,用缺乏目的抗原的同源对照。作一个没有第一抗体的对照也是有帮助的。

7. 吸出第一抗体,用 PBS  3  BSA  3 次。

8. 用荧光第二抗体重复第 6  7 步(在暗处培养)。

9. 吸出第二抗体,用 PBS  3  BSA  3 次。

10.   10  15ml  1 μ g/ml DAPI 到载玻片孔中,培养约 1 分钟,用 PBS  3 次。

11.  吸出 PBS ,给每个孔加一小滴封固剂,放盖玻片,避免在孔中出现气泡。用纸巾除去多余的封固剂,小心不要移动盖玻片,用干净的指甲油密封,- 20 ℃下保存。

免疫荧光

 1 )细胞制备

 1. 培养 5ml 酵母至对数生长早期( 106 ~ 107 细胞 /ml )。

2. 直接加 1/10 体积的甲醛到培养基里固定细胞(加入的甲醛终浓度为 3.7 %,标准母液是 37 %)。

3. 细胞在甲醛中培养至少 1 小时。

4. 离心收集细胞,用 0.1mol/L 磷酸钾( pH7.5 )洗一次。

5. 把细胞悬浮在 1ml  50mg/ml 消解酶 100T  50 单位 /ml 的溶细胞酶 [ 溶于含有 2ml/ml 6- 巯基乙醇的 0.1mol/L 的磷酸钾溶液中 ] 

6.  30 ℃培养 30 分钟,用相差显微镜检查原生质的生成率。细胞应呈黑色或半透明灰色,亮细胞(折射体)属于没有充分被消化的。菌蜕属消化过夜。

7. 离心收集细胞,悬浮在 1ml  PBS 中。

 2 )染色

 1.  10ml  1mg/ml 聚赖氨酸,放到用特氟隆封闭的( Teflonmasked slides )载玻片( 10 孔载玻片)上的每个孔,再用蒸馏水洗载玻片,干燥。

2.  10ml 固化细胞到每个孔中,几分钟后,用 PBS 抽洗 3 次。用显微镜检测载玻片确保呈合适的密度而不聚集。

3. 该步骤可任选(本实验不需要使用抗体,但建议使用):把载玻片浸泡在冷甲醇(- 20 ℃) 6 分钟后,然后放到冷丙酮(- 20 ℃) 30 秒,该处生理产生扁平细胞,有助于细胞骨架的观察。对于一些抗体 - 抗原结合物,需要这些步骤重新活化,用 PBS 重新润湿玻孔。

4.  15ml  PBS  3  BSA (牛血清白蛋白)组成的阻断缓冲液到玻孔中。在保湿盒子中,如垫有湿纸巾的平板中保温 30 分钟。重要的是,在这期间不能让载玻片孔干透( BSA 可通过阻断蛋白质结合位点降低非特异抗体结合到载玻片)。

5. 吸出阻断缓冲液,用 PBS  3  BSA 洗两次。

6.  10  15ml 第一抗体(溶解在 PBS  3  BSA )到载玻片孔中,在一个保湿盒中保温 1 小时。用亲和纯化抗体或单克隆抗体,如果可能,用缺乏目的抗原的同源对照。作一个没有第一抗体的对照也是有帮助的。

7. 吸出第一抗体,用 PBS  3  BSA  3 次。

8. 用荧光第二抗体重复第 6  7 步(在暗处培养)。

9. 吸出第二抗体,用 PBS  3  BSA  3 次。

10.   10  15ml  1 μ g/ml DAPI 到载玻片孔中,培养约 1 分钟,用 PBS  3 次。

11.  吸出 PBS ,给每个孔加一小滴封固剂,放盖玻片,避免在孔中出现气泡。用纸巾除去多余的封固剂,小心不要移动盖玻片,用干净的指甲油密封,- 20 ℃下保存。




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